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I ricercatori hanno sviluppato una nuova tecnica di editing genetico per rimodellare completamente il genoma. Chiamato “bridge editing”, consente, tra le altre cose, di indurre cambiamenti molto più significativi di quanto sia attualmente possibile con la tecnica CRISPR, in particolare inserendo direttamente nuove sequenze di DNA nel genoma. Ciò gli conferisce un livello di precisione mai raggiunto prima con le attuali tecniche di editing.
I sistemi guidati dall’RNA hanno rivoluzionato la nostra comprensione del genoma. Tra questi sistemi c’è la tecnica di editing genetico CRISPR, che funziona come “forbici” molecolari guidate da RNA guida (gRNA). La tecnica permette, tra le altre cose, di sezionare e modificare una specifica sequenza genetica personalizzando il gRNA.
L’intero processo è mediato dalla proteina CRISPR Cas. Il termine Cas si riferisce a una nucleasi che si lega a un breve CRISPR RNA (crRNA) mirando alle relative sequenze di DNA o RNA. Le endonucleasi Cas9 e Cas12 scindono il DNA, mentre Cas13 scindono l’RNA. Quando lo strumento molecolare taglia la sequenza da prendere di mira, la cellula induce sistematicamente un processo di riparazione. La scissione viene eseguita ripetutamente finché la cellula non muta naturalmente inducendo un errore di riparazione.
Tuttavia, sebbene la tecnica CRISPR permetta di indurre una mutazione in siti specifici, il suo livello di precisione è relativamente limitato. Taglia e danneggia le sequenze bersaglio per inattivarle, rendendola più una tecnica distruttiva che di editing.
Per rimediare a questo, sono state proposte versioni migliorate di CRISPR, che consentono ad esempio di modificare direttamente le sequenze bersaglio anziché fare affidamento su cicli di riparazione-mutazione. Alcuni consentono di modificare le basi nucleotidiche senza passare attraverso il processo di scissione, mentre altri consentono di convertire i gRNA in DNA e inserirli nella sequenza da prendere di mira. Anche in questo caso, però, la precisione resta limitata.
Un team dell’Arc Institute, l’Università della California a Berkeley, Stanford e Tokyo, propone una nuova tecnica di editing programmabile che consente di inserire direttamente nuove sequenze di DNA nel genoma utilizzando i “ponti RNA” – una nuova categoria di RNA guida. Ciò migliorerebbe significativamente la precisione dell’editing genetico utilizzando una singola sequenza di inserimento.
« Il sistema di bridging dell’RNA è un meccanismo fondamentalmente nuovo per la progettazione del genoma “, spiega in un post sul blog dell’Arc Institute il ricercatore principale dello studio, Patrick Hsu, anche lui professore di bioingegneria all’Università della California a Berkeley. “ La ricombinazione del ponte può modificare universalmente il materiale genetico attraverso l’inserimento, l’escissione, l’inversione di sequenze specifiche e altro ancora, consentendo un editing del genoma vivente più efficiente rispetto a CRISPR ».
“Bridge RNA”: un adattatore universale che consente di colpire qualsiasi parte del genoma
Scoperto nei batteri e negli archaea, il nuovo sistema di editing molecolare studiato dal team si basa su una sequenza chiamata “inserimento 110 (IS110)”. Fa parte di un ampio insieme di sequenze trasponibili (o “geni saltatori”) che tagliano, si muovono all’interno del genoma, quindi si attaccano (o si inseriscono) tra due filamenti specifici.
Queste brevi sequenze sono presenti nelle cellule di tutti gli esseri viventi e si sono evolute fino a diventare veri e propri strumenti di manipolazione del DNA. IS110 in particolare è costituito da un gene che codifica per un enzima ricombinasi, responsabile della ricombinazione genetica. È un processo che porta alla modificazione dell’associazione fisica tra due segmenti di DNA.
Esperti in un nuovo studio – pubblicato sulla rivista
Natura — ha utilizzato la microscopia crioelettronica per studiare le strutture molecolari del complesso ponte-ricombinasi dell’RNA. Sono progrediti in fasi dal processo di scissione IS110 alla fase di ricombinazione.
Hanno scoperto che quando IS110 viene eliminato dal genoma, le estremità non codificanti del filamento di DNA si uniscono per produrre due anelli di RNA a ponte. Uno degli anelli si lega a IS110 mentre l’altro si lega al filamento bersaglio in cui verrà inserita la nuova sequenza, rendendo il bridging RNA il primo esempio di gRNA bispecifico. La ricombinasi induce quindi il processo di inserimento.
D’altra parte, ciascun RNA ponte è programmabile, il che rende possibile associare qualsiasi sequenza di DNA bersaglio e donatore. In altre parole, lo strumento consente di inserire qualsiasi sequenza di DNA in qualsiasi posizione genomica target. “ Questi ponti RNA programmabili distinguono IS110 da altre ricombinasi note, che non contengono un componente RNA e non possono essere programmate “, spiega il coautore principale dello studio, Nicolas Perry, anche lui dell’Arc Institute e dell’Università della California. Per analogia, “è come se il bridge ARN fosse un adattatore di alimentazione universale che rende l’IS110 compatibile con qualsiasi presa”, afferma.
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Gli elementi genetici mobili IS110 esprimono un ncRNA (non codificante) legato dalla sua ricombinasi codificata. UNRappresentazione schematica della sequenza della proteina ricombinasi IS110. BRappresentazione schematica della struttura e del ciclo di vita di un elemento IS110. CUn albero filogenetico a radice media costruito da 1.054 sequenze di ricombinasi IS110. DDistribuzione delle lunghezze terminali non codificanti in otto famiglie IS. egrafico di copertura del sequenziamento dell’RNA delle estremità concatenate non codificanti di IS621 e di cinque ortologi correlati espressi dal loro promotore endogeno nei batteri E.
coli . FRappresentazione di una ricombinasi IS621 marcata in modo fluorescente con ncRNA wild-type o codificato per misurare la costante di dissociazione dell’equilibrio (KD). G, Struttura secondaria di consenso degli ncRNA costruita da 103 sequenze IS110. ©
Matthew G. Durrant et al.
Precisione superiore al 94%
Questo meccanismo conferisce al nuovo sistema un livello di precisione che non potrebbe mai essere ottenuto con la tecnica CRISPR. Quando si testano i batteri Escherichia coliil team ha dimostrato che l’efficienza dell’inserimento di un dato gene era superiore al 60%, mentre la capacità di inserirlo nella posizione corretta era superiore al 94%.
Inoltre, la tecnica permette di ricombinare due filamenti di DNA senza rilasciare le estremità precedentemente scisse di quest’ultimo. Queste sequenze cosiddette “cicatrici” costituiscono una limitazione significativa delle tecniche di editing genetico attualmente utilizzate.
Tuttavia, è importante notare che la tecnica è stata finora testata solo sui batteri e la sua efficacia su altri tipi di cellule, compreso l’uomo, resta da dimostrare. Tuttavia, alla fine potrebbe aprire la strada a nuovi tipi di terapie geniche. Secondo gli esperti, la ricerca futura si concentrerà sull’applicazione dello strumento alle cellule umane, migliorandone la precisione e l’efficienza, nonché sull’esplorazione di potenziali funzioni aggiuntive.
Video esplicativo dello studio:
